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His標籤蛋白純化常見問題解答

發佈時間:2019-05-15 13:16:13 點擊次數:

Q:層析柱堵塞?

A:待純化蛋白樣品中存在固體雜質,多見於菌體裂解液直接上樣。建議對樣品微濾 (0.45μm) 處理。


Q:目的蛋白不與介質結合?

A:

• 目的蛋白沒有 His 標籤,其原因可能是載體構建有誤、表達提前終止 (C端融合表達His 標籤)、二級翻譯起始 (N端融合表達His標籤)等等。建議測序檢查,或嘗試更換表達載體。

• His標籤摺疊在蛋白質內部沒有暴露。該情況多見於包涵體蛋白在變性條件下的純化。建

議充分變性蛋白,可以嘗試使用更強的變性劑 (如用6 M鹽酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶劑 (SDS) 或還原劑 (DTT、β-巰基乙醇) 等方法。

• 緩衝液存在問題。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介質純化 His 標籤蛋白時,平衡緩衝液與樣品緩衝液中的某些組分可能會干擾目的蛋白的結合。

部分組分建議濃度如下 :

 EDTA: ≤0.1 mM (建議不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)


Q:洗脫液中雜蛋白多?

A:

• 洗脫條件不合適。建議使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質最佳洗脫條件不同,需要摸索優化。

• 雜蛋白與介質存在非特異性結合。建議在平衡緩衝液與樣品緩衝液中加入一定濃度的咪唑 (推薦濃度 : ≤20 mM,因蛋白而異),抑制非特異性結合。

• 雜蛋白與目的蛋白存在非特異性結合。建議在平衡緩衝液與樣品緩衝液中加入非離子型去垢劑 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、還原劑 (β- 巰基乙醇 : ≤20 mM) 等組分。

• 目的蛋白降解。建議在低溫下純化目的蛋白,並在平衡緩衝液與樣品緩衝液中加入蛋白酶抑制劑 (如 PMSF)。

• 存在表達提前終止 (C 端融合表達 His 標籤) 或二級翻譯起始 (N端融合表達 His 標籤)。建議更換表達載體。


Q:目的蛋白沒有洗脫?

A:

• 目的蛋白量太少,無法檢出。建議更換靈敏度更高的檢測方法,如用銀染法或 Western Blot 替代考馬斯亮藍染色,或優化上游表達條件,獲得更多的目的蛋白。

• 目的蛋白沒有結合介質。建議檢測以下全部樣品以確認蛋白:上樣前、流出、洗滌、洗脫。

• 目的蛋白結合牢固。建議增加洗脫強度,如採用更高濃度的咪唑或更低的 pH 值。


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