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原核蛋白表達常見問題解答

發佈時間:2019-05-15 13:14:37 點擊次數:

Q:蛋白不表達或表達量很低?

A:

1、選擇正確的表達載體與表達菌株

• T7啓動子的載體(如pET系列載體)應選用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7啓動子的表達載體 (如Tac啓動子的pGEX、pMAL系列表達載體) 應選用BL21表達菌株。

• 對細胞有毒性的蛋白,建議選用背景表達低、嚴謹調控誘導的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。

• 對於帶有稀有密碼子的蛋白或來源於真核基因的蛋白,建議選用Transetta(DE3) 等菌株。

2、嘗試不同的表達載體與菌株

  不同的蛋白,對不同載體與菌株的偏好不同,如果某一蛋白無法通過優化誘導表達條件得到明顯改善,可以更換其它菌株或表達載體。

3、表達條件的優化

• 選擇不同的培養基。對於某些蛋白,在培養基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明顯提高表達量。

• 較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間,一般可以加快表達的速度,促進目的蛋白的積累,從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量,形成包涵體。

• 細胞的生長狀態對蛋白表達有很大的影響,可以通過測量菌液的OD600值監測生長狀態。對於大部分蛋白,應在菌株的對數生長期(OD600=0.5) 進行誘導。


Q:目的蛋白不可溶,形成包涵體?

A:

首先確認目的蛋白是否有表達。

• 裂解菌體並離心後,通過對全菌、上清、沉澱的檢測,確認目的蛋白是否表達,是否形成了包涵體。

• 包涵體的形成與蛋白自身結構、表達系統、誘導表達條件等因素有着密切關係。在無法改變蛋白自身結構的情況下,可以嘗試不同的表達載體與菌株,增強其溶解能力,優化出適合特定蛋白的表達系統。

• 目前認爲包涵體的形成是由於蛋白在細胞內積累速度過快,沒有正確摺疊而聚集沉澱。可以通過優化誘導表達條件,如降低誘導溫度、降低誘導物濃度、縮短表達時間、降低誘導時菌液的OD值等,以減緩蛋白的積累。


Q:目的蛋白大小不正確?

A:

• 蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響。可以通過加熱變性蛋白,從而準確判斷蛋白分子量大小。

• 確認蛋白表達是否完整,蛋白是否提前終止表達。

• 若形成二聚體甚至多聚體,可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段,破壞次級結構,準確判斷分子量大小。


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