產品FAQ

质粒DNA纯化常见问题解答

Q:產量低

A:

• 檢查細胞生長情況,培養條件是否適合質粒增殖。儘可能選擇高拷貝數的質粒。

• 如果質粒拷貝數低,可適當增加收集的菌液量,但是要保證菌體可以被完全裂解。

• 如果裂解液過於粘稠,應適當減少菌體量。

• 培養時間過長或在 2-8℃保存時間過長會明顯降低產量,建議使用新鮮的菌液。


Q:質粒 DNA 中有基因組 DNA 污染

A:裂解時間不宜超過 5 分鐘。


Q:影響下游酶切

A:洗滌液 WB 洗滌後應儘量離心去除殘留的液體,待硅膠膜完全乾燥後再加入洗脫緩衝液。


基因组DNA纯化常见问题解答

Q:DNA 產量低

A:

• 裂解不充分:減少起始材料的用量。檢查樣品中是否加入了 Proteinase K溶液。如果提取的材料爲動物組織,儘量將組織切碎,並要保證材料完全浸泡在裂解液中。適當延長裂解時間。

• 提取材料質量不好:儘量選用新鮮材料,樣品採集後應儘快保存在 -70℃或液氮中。DNA 的產量取決於材料的種類和幼嫩程度。

• 離心柱堵塞:過柱前檢查裂解液是否清亮,去除溶液中過於粘稠的不溶物。

• 洗滌溶液中未添加無水乙醇。必須在洗滌溶液中添加合適比例的無水乙醇。

• 洗脫條件不合適:洗脫液 EB 或超純水最好預先加熱至 70℃,用超純水洗脫前應檢查其pH 值是否在 7.0-8.5 之間,如 pH 值小於 7 將明顯影響洗脫效率,需調節後再進行洗脫。洗脫液應儘量加到離心柱的中央,在離心前室溫靜置 1 分鐘。

• DNA 斷裂或降解:避免因移液槍反覆吹吸或反覆凍融樣品造成的 DNA 損傷。避免在操作過程中帶入外源 DNase 污染。


Q:洗脫液顏色發黑或硅膠膜脫色 ( 動物組織或鼠尾材料 )

A:來源於組織的色素大量結合在離心柱上並與 DNA 一併洗脫:在過柱前檢查是否已加入乙醇,乙醇可防止色素與硅膠膜結合。在裂解液結合步驟可適當加大轉速和延長離心時間。

• RNA 污染:可在樣品材料製備過程中添加適量的 RNase A 降解 RNA。


Q:影響下游的酶切

A:

• 純化的 DNA 中有乙醇殘留:在洗滌步驟中可能會帶來乙醇的殘留。加入洗脫液之前將離心柱在最大轉速下離心 2-3 分鐘徹底乾燥離心柱。

• 純化的 DNA 中有鹽分殘留:採用正確的洗滌操作步驟,用不同 CB 溶液洗滌後再用 WB 洗滌。


克隆常见问题解答

Q:如何選擇合適的克隆載體?

A:Taq系列酶擴增的片段,選用T載體;Pfu系列酶擴增片段,選用Blunt系列載體,也可以加“A”後和T載體連接,但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質粒DNA,推薦使用雙抗性載體。


Q:插入片段的量多少合適?

A:

• 片段加入量可根據片段長度不同進行調整。 最佳插入片段DNA量:載體與片段摩爾比=1:7

• 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計算。(如1 kb加20 ng,1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標準粗定量即可)

• 片段加入量最大爲4μl,即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少爲0.5μl,可以補充無菌水以方便操作。

• 反應溫度範圍:20-37℃,最適反應溫度爲25℃。


Q:反應時間多長合適?

A:

• 大多數1 kb以內的PCR產物室溫反應5分鐘即可完成反應。以下幾種情況可以延長反應時間以獲得更理想的效果:

• 具有特殊結構(高AT/高GC/反向重複序列)的片段:10-20分鐘。

• 膠回收片段或加"A"片段:10-15分鐘(該條件適用於3 kb以內的片段)。

• 大於3 kb的PCR產物需延長至15-20分鐘。


Q:連接產物可以保存多久?

A:連接產物可以置於-20℃或2-8℃冰箱,一週內使用。


Q:多克隆位點上的酶切位點切不開?

A:篩選到的克隆來源於模板質粒而不是連接產物。推薦使用雙抗載體,篩選時使用模板質粒不具有的抗性。


Q:克隆數少或陽性率低?

A:

• 影響克隆數目和克隆效率的因素有許多,如感受態細胞效率、插入片段質量、基因結構、插入片段長度、插入片段和載體的比例等。如發現克隆數少或克隆效率低,可嘗試下列方法:

• 感受態細胞的轉化效率對克隆數有重要影響,轉化效率高低與連接產物克隆數的多少不呈線性關係。假設細胞轉化效率爲1×109 cfu/µg DNA時,克隆數爲1000;轉化效率爲1×108 cfu/µg DNA時,克隆數並不是100,而是低於100。爲保證克隆數,請選用高轉化效率的Trans1-T1感受態細胞。

• 使用新鮮的PCR產物:PCR產物於2-8℃保存,1-2天內使用。對於膠回收產物,應儘量縮短紫外照射時間並適當延長反應時間 (10-15分鐘)。

• 目的片段濃度極低時,進行濃縮,以保證反應時分子碰撞機率。

• 毒基因:使用Trans10感受態細胞。

• 具有特殊結構 (高AT/高GC/反向重複序列) 的基因:適當延長反應時間至10-20分鐘。


Q:PCR鑑定重組子失敗?

A:當用通用引物鑑定重組子,沒有得到目的擴增產物,又沒有載體自連帶,說明PCR失敗。重新優化PCR條件或提取質粒,以質粒作模板擴增或酶切鑑定包含重組子的克隆。


Q:重組克隆呈現淡藍色或“Fish eye”?

A:插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框,或插入片段太短 ,這種情況下克隆呈現淡藍色或“Fish eye”,可正常鑑定。


DNA Marker使用常见问题解答

Q:電泳條帶模糊?

A

• 電泳緩衝液緩衝能力差。 電泳緩衝液多次使用後,離子強度降低,pH值上升,緩衝性能下降,可使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA條帶遷移的現象。

電壓過高,電泳時間過長。電泳時電壓不應該超過20 V/cm,電泳溫度應該低於30℃。如果電泳時電壓和溫度過高,可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA條帶遷移的現象。特別是電壓太高易出現缺帶現象。電泳過程中由於會產熱,因此電泳時間長容易發生條帶模糊,特別是小片段會變得模糊。

凝膠放置時間太長或瓊脂糖的質量差,導致DNA 條帶分辨率降低。


QDNA Marker 降解?

A:污染了核酸外切酶。建議用滅菌的槍頭,用後及時將管蓋擰緊。點樣時勿將電泳緩衝液帶入管中,建議更換槍頭。


Q:用EB瓊脂糖膠電泳不同時間會出現條帶亮度變化?

A:由於電泳過程中條帶與EB泳動方向相反,結合EB的量會隨時間變化,因此電泳後條帶亮度會發生變化。因此建議使用EB染膠實現精準定量。


QDNA Marker泳條帶分離效果不好?

A:瓊脂糖制膠濃度不合適,導致分辨率降低。制膠不均勻有時也會導致電泳異常。建議使用新制備的凝膠,制膠時注意操作中帶來的濃度誤差。一般對於大分子量片段,低濃度膠分離效果好;對於小分子量片段,高濃度膠分離效果好。


Q:不同核酸染料對DNA Marker 遷移率的影響?

A:預加GeneFinder、GelStain、GoldView到DNA Marker中,對Marker的遷移率都有一定的影響。


限制性内切酶常见问题解答

Q:不酶切或酶切不完全

A:

• 酶失活或濃度過低:用已知含目的酶切位點的對照 DNA 測試該酶活性;酶應貯存於 -20℃,-70℃時會凍結;避免反覆凍融降低酶活;可根據實驗要求適當加大酶

量。

• DNA 濃度不合適:推薦 50 μl 反應體系酶切 1-2 μg DNA;DNA 過量時可適當增加酶量。

• DNA 被抑制劑污染:與對照 DNA 樣品一起酶切,驗證其是否被抑制;重新純化 DNA 樣品。

• DNA 可能形成超螺旋:不同酶對超螺旋結構 DNA 消化效率不一樣,可適當加大酶量。

• 識別位點過於接近 DNA 末端:一般在識別位點兩端各加 6 個保護鹼基可確保酶切效率。

• 識別位點不存在:驗證 DNA 序列。

• 反應條件非最優化:緩衝液使用不當;按比例使用新鮮緩衝液重複實驗;按照推薦方案進行雙酶切或分步酶切。

• 甲基化封閉酶切位點:PCR 產物未甲基化;使用 dam-/dcm-菌株轉化。


Q:出現非預期帶型

A:

• 確定正確帶型:酶切產物與對照 DNA 樣品一起電泳,確定是未消化完的底物條帶或者是星號活性產生的非預期條帶。

• DNA 樣品污染:重新制備或純化樣品

• 含其它酶切位點:驗證 DNA 序列


Q:DNA 電泳呈彌散帶

A:

• 酶與 DNA 結合緊密未完全解離:使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳;或另加入終濃度爲0.05-0.2% 的 SDS。

• 核酸酶污染:製備新的底物樣品;使用新的緩衝液和水。

• 電泳條件不合適:使用新鮮的電泳緩衝液和凝膠;合適的電流電壓避免過熱。


Q:星號活性 (特異性降低或改變)

A:

• 高甘油濃度 (>5% v/v):酶儲存液含 50% 甘油;因此酶量不超過反應體積的10%。選擇 50 μl的標準反應體系,以減少反應過程中水的蒸發而提高甘油濃度。

• 非最適緩衝液:儘可能使用推薦緩衝液,離子濃度和 pH 的改變會引起星號活性。

• 存在有機溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等):確保樣品在製備過程中不含任何有機物,如 DNA 製備過程中可能混入的乙醇。

• 混有其它二價離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價離子


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